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 惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床上實(shí)體惡性腫瘤治療失敗或復(fù)發(fā)的主要原因之一。而循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在正是實(shí)體惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的最經(jīng)典依據(jù)是1889年Paget[1]提出的“種子和土壤”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，是處于活躍或活化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞作為“種子”，當(dāng)遇到適合的器官、組織的基質(zhì)環(huán)境，即“土壤”時(shí)，就會(huì)在此定居、生長(zhǎng)即發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而部分解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的關(guān)系。但原發(fā)部位的腫瘤（種子）是如何到達(dá)遠(yuǎn)處器官或組織（土壤）的這一問(wèn)題一直困擾著人們。直到1869年，托馬斯?阿什沃思（Thomas Ashworth）[2]在1例轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到了外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）—從實(shí)體瘤中脫離出來(lái)并進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。他推測(cè)，這些細(xì)胞在癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用，并可能提供疾病進(jìn)展的相關(guān)信息，CTCs的概念初步形成。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上的腫瘤病人死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，實(shí)體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞在特定條件下，通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從形態(tài)上發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力。間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞相鄰，只是其結(jié)構(gòu)松散，缺乏細(xì)胞連接（cell adhesion）和細(xì)胞極性，并且具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力。因此，脫落的CTCs得以進(jìn)入外周血液循環(huán)，這是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提。脫離原發(fā)灶入血的CTCs至少面臨著血流剪應(yīng)力、失巢凋亡、免疫細(xì)胞識(shí)別殺傷等三重致命考驗(yàn)，進(jìn)入循環(huán)的大部分腫瘤細(xì)胞都會(huì)失去活性，只有不足0.01%可到達(dá)遠(yuǎn)端器官，通過(guò)遷移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在適合的微環(huán)境條件下，CTCs又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition，MET），生成新的腫瘤，從而導(dǎo)至腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

 

從提出CTCs概念近一個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間里，由于初期實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)的限制以及學(xué)者對(duì)CTCs的認(rèn)識(shí)的局限性，CTCs檢測(cè)及臨床應(yīng)用進(jìn)展不大。直至上世紀(jì)末尤其是本世紀(jì)初，隨著分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，免疫標(biāo)記技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，CTCs分離及分析鑒定技術(shù)得以迅速發(fā)展，CTCs檢測(cè)和臨床應(yīng)用取得了重大進(jìn)步，為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、評(píng)估手術(shù)、放療、化學(xué)等療效、判斷預(yù)后、確定腫瘤分子特征、選擇合適的個(gè)體化治療等方面提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。目前，學(xué)者所共識(shí)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念是：自發(fā)或受外界因素作用（如診療操作等）由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶提供了可能。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞大部分在機(jī)體免疫識(shí)別及殺傷等作用下發(fā)生凋亡，有極少數(shù)腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來(lái)，在一定條件下，進(jìn)入血液循環(huán)而未被清除的腫瘤細(xì)胞通過(guò)遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[3]。本文擬就CTCs分離技術(shù)、分析鑒定技術(shù)、臨床應(yīng)用、CTCs主要分析儀器作一介紹。

 

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離富集技術(shù)

 

越來(lái)越多的分子生物學(xué)和臨床研究結(jié)果表明，腫瘤轉(zhuǎn)移很可能在腫瘤發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)，在外周血中檢到CTCs是預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移最直接、重要的方法，在腫瘤早期轉(zhuǎn)移的臨床診斷、預(yù)后判斷、監(jiān)測(cè)療效等方面具有重要意義。CTCs的發(fā)現(xiàn)有望改變臨床上仍依賴于影像學(xué)檢查及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的現(xiàn)狀。由于外周血中的CTCs含量極為稀少，一般認(rèn)為在外周血中大約105~107個(gè)單核細(xì)胞中才有一個(gè)CTCs[4]，因此，對(duì)CTCs檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性提出了極高的要求。目前各種CTCs的檢測(cè)系統(tǒng)主要包括CTCs分離和富集系統(tǒng)以及CTCs的檢測(cè)和鑒定系統(tǒng)。而分離和富集系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)外周血的CTCs是非常必要的。理想的CTCs分離與富集及檢測(cè)技術(shù)應(yīng)能達(dá)到以下六點(diǎn)要求：（1）高捕獲率或高靈敏度，就是可以將樣品中的CTCs盡可能多的分離出來(lái)，即至少能夠在上億個(gè)血循環(huán)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個(gè)腫瘤細(xì)胞；（2）高特異性，要求檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，盡可能降低假陽(yáng)性或假陰性，目標(biāo)是分離出來(lái)的細(xì)胞只有CTCs，其它細(xì)胞的含量很少或沒(méi)有；（3）要求CTCs不能被污染，收集到的CTCs可以進(jìn)行表型和基因型分析；（4）高通量，即能在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品；（5）重復(fù)性，回收率高。（6）盡可能降低成本[5、6]。目前用于臨床實(shí)驗(yàn)研究的CTCs分離和富集技術(shù)非常之多，一般來(lái)講根據(jù)其物理性質(zhì)和基于親和性與識(shí)別的生物性質(zhì)以及兩者綜合利用可分成3類(lèi)。但目前來(lái)說(shuō)仍沒(méi)有理想的方法，每種單獨(dú)的方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。雖然兩種或三種方法的結(jié)合有可能成為較為理想的方法，但近十幾年的研究進(jìn)展不大。

 

1.1 密度梯度離心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）

 

密度梯度離心的原理是基于血液中各種正常細(xì)胞與CTCs密度的差別，利用其在密度梯度介質(zhì)（如Ficoll-Paque介質(zhì)、OnceQuick系統(tǒng)）中的沉降系數(shù)不同，將細(xì)胞懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力的作用，用分離液將CTCs與其它細(xì)胞層分離。離心后在細(xì)胞分離液中各種細(xì)胞呈現(xiàn)梯度分布，依次為：血漿成分、單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）、分離液、中性粒細(xì)胞和最下層的紅細(xì)胞，從而獲取目標(biāo)細(xì)胞。有報(bào)道用OnceQuick系統(tǒng)分離腫瘤細(xì)胞得到了632倍的富集效果，標(biāo)明該系統(tǒng)對(duì)CTCs的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque介質(zhì)只有3.8倍。DGC方法操作簡(jiǎn)便、成本低，但該分離方法一般要求血量較大，且靈敏度和特異性均較低，且在操作過(guò)程中可能會(huì)損失CTCs。

 

1.2 細(xì)胞過(guò)濾技術(shù)（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

 

ISET方法的原理是基于細(xì)胞大小不同和機(jī)械性能的差別。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的直徑為15~30μm，大于絕大多數(shù)血細(xì)胞的直徑（如紅細(xì)胞5~9μm），根據(jù)細(xì)胞大小所設(shè)計(jì)的濾過(guò)膜濾過(guò)血液樣本后將直徑大的腫瘤細(xì)胞分離出來(lái)。但由于目前還沒(méi)有報(bào)道證實(shí)所有腫瘤細(xì)胞直徑都大于8μm，使其分離敏感性受到質(zhì)疑。該方法對(duì)技術(shù)、設(shè)備要求不高，但會(huì)丟失一小部分直徑小于濾膜孔徑的CTCs，導(dǎo)至檢測(cè)靈敏性降低。

 

1.3 細(xì)胞粘附技術(shù)（Cell adhesion techniques，CAT）

 

細(xì)胞粘附分離技術(shù)是CTCs捕獲的一項(xiàng)基本技術(shù)，利用的是親和反應(yīng)原理，即利用CTCs與生物生化修飾或物理修飾捕獲表面的親和作用，含有CTCs的樣本經(jīng)過(guò)捕獲表面時(shí)，CTCs則被吸附在捕獲表面，隨后沖洗掉未被粘附的非目的細(xì)胞，從而得到CTCs。此后發(fā)展起的多種納米及微流控技術(shù)都采用了這一基本技術(shù)。

 

1.4 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic separation，IMS）

 

與普通血細(xì)胞相比，CTCs具有某些特殊的生物標(biāo)志物，包括CTCs表面的上皮細(xì)胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及腫瘤特異性抗原，而血液中幾乎所有的細(xì)胞都是反磁性或弱磁性的，利用腫瘤細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場(chǎng)中通過(guò)相應(yīng)抗原抗體復(fù)合物與磁珠吸附而滯留在磁場(chǎng)中或定向移動(dòng)到指定區(qū)域，沒(méi)有表面抗原的其它細(xì)胞由于不能與連接磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而不能在磁場(chǎng)中停留，從而使腫瘤細(xì)胞得以從血液中分離出來(lái)[7]。該方法的敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表達(dá)的制約。例如：采用EpCAM抗體捕獲CTCs，由于EpCAM在CTCs的表達(dá)率一般為60-70%，往往會(huì)丟失部分CTCs；單一的CK抗體也不能完全識(shí)別癌細(xì)胞表達(dá)的所有CKs；在CTCs上皮間質(zhì)化過(guò)程中，一些基于標(biāo)準(zhǔn)化上皮標(biāo)志物的篩選抗體無(wú)法檢測(cè)出所有CTCs等等。這一切都受到目標(biāo)抗原的表達(dá)量與特異性以及與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力影響。

 

1.5 納米基質(zhì)分離技術(shù)（Nanoimprint matrix isolation technology）

 

納米技術(shù)在納米尺度對(duì)檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和操作，是一門(mén)融合化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)和藥學(xué)的交叉學(xué)科。通過(guò)在基底表面制備納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)細(xì)胞界面，并修飾相應(yīng)的特異性識(shí)別分子，可以將血液中的CTCs捕獲并分離出來(lái)。陸寧寧等[8]綜述了據(jù)此思路研發(fā)的技術(shù)設(shè)備有：（1）納米柱、納米線及納米纖維：在CTCs捕獲裝置中，納米柱、納米線及納米纖維基質(zhì)均可通過(guò)多種方式獲得。如利用濕法刻蝕或化學(xué)氣相沉積法可制備納米柱或納米線基質(zhì)；（2）納米粗糙表面：由于CTCs的黏附性較血液中其它細(xì)胞強(qiáng)，所以粗糙界面的構(gòu)建為CTCs高效分離提供了另外一種選擇；（3）碳納米材料：以碳納米管、石墨烯為代表的碳納米材料因具有高比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)電性能和良好的生物相容性等特點(diǎn)，成為了生物傳感器、儲(chǔ)能材料、藥物載體以及高分子等領(lǐng)域中的常用材料；（4）仿生材料：自然粒子如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和花粉，因具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)眾多優(yōu)良性能。以這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的自然粒子為模板，可制備具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的仿生材料。相對(duì)于傳統(tǒng)的CTCs分離法的分類(lèi)效率及特異性有了極大的提高，并且制備簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜昂貴的微加工設(shè)備。

 

1.6 微流控芯片技術(shù)（Microfluidic chip technology）

 

微流控芯片技術(shù)（Microfluidics）是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上， 自動(dòng)完成分析全過(guò)程。微流控技術(shù)可在微米結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積液流，是近年來(lái)迅速崛起的集生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域?；谖⒘骺匦酒?/span>CTCs分離技術(shù)通過(guò)在芯片通道內(nèi)部修飾可識(shí)別的細(xì)胞表面抗原的抗體或核酸適配體，當(dāng)通入含CTCs的樣本時(shí)，CTCs與通道表面捕獲試劑結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特異性分離。該方法所需樣品量小，無(wú)需對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，且流動(dòng)的流體環(huán)境有利于去除非特異性吸附的其它細(xì)胞，從而提高分離純度。Dharmasiri等[9]采用包被了EpCAM抗體和抗-PSMA核酸適配體的芯片從血液樣本中分離了不同的CTCs，其捕獲率大于90%，純度達(dá)到100%，如將芯片通道中的平的捕獲表面用抗體修飾的納米結(jié)構(gòu)表面替代，CTCs捕獲率甚至可以提高到95%。微流控芯片是一個(gè)集樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能于一體的小型分析實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。最早用于制作微流控芯片的材料主要是石英、玻璃及單晶硅片，隨著技術(shù)的進(jìn)步，一系列有機(jī)聚合物如聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PolymethylMethacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）等材料已發(fā)展成為芯片制作的常用材料。目前根據(jù)微流控技術(shù)使用的原材料可分為基于硅材料的微流控芯片、基于PDMS/玻璃的微流控芯片、基于熱聚膜的微流控技術(shù)（如PMMA）、基于微流控芯片平臺(tái)的磁分離技術(shù)、基于微流控芯片平臺(tái)的微納米基質(zhì)分離技術(shù)等[7]。

 

除微流控芯片技術(shù)外，微流控技術(shù)（Microfluidics）還在其它循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選富集方法中，取得了迅速發(fā)展。在微流控器件中從血液樣品注入到循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的過(guò)程，極大地簡(jiǎn)化了操作程序，并可減少目標(biāo)細(xì)胞的損失。黃笛等根據(jù)作用方式將微流控分選富集技術(shù)分為被動(dòng)分選和主動(dòng)分選兩大類(lèi)：被動(dòng)分選技術(shù)包括微結(jié)構(gòu)過(guò)濾、場(chǎng)流及水力分選、確定性側(cè)向偏移、慣性分選、仿生分選、親和性分選等方法，一般具有通量高、不需要額外施加作用立場(chǎng)的優(yōu)點(diǎn)；主動(dòng)分選技術(shù)包括介電泳分選、磁分選、聲分選、光分選等方法，一般具有分選精度高的優(yōu)點(diǎn)[10]。

 

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)

 

經(jīng)過(guò)上述方法分選富集的CTCs需要進(jìn)一步分析鑒定，選用特異性的檢測(cè)技術(shù)或方法對(duì)CTCs及其分子進(jìn)行確認(rèn)是循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的重要步驟。常用的鑒定檢測(cè)技術(shù)包括免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry，ICC）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）、熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，FCM）等。

 

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry，ICC）

 

是以顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和細(xì)胞化學(xué)呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性和定量的技術(shù)。目前選擇的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)抗原包括EpCAM、上皮角質(zhì)蛋白（CKs）、上皮細(xì)胞膜特異性抗原、腫瘤相關(guān)糖蛋白（TAG）或特異性標(biāo)志物（如HER2、抗乳球蛋白等）。其優(yōu)點(diǎn)在于腫瘤細(xì)胞膜未被破壞，可以進(jìn)行后續(xù)研究，但此法敏感性低、檢測(cè)繁瑣、易誤診。近年來(lái)研發(fā)出的光纖陣列掃描儀（Fiber scanning technology，FAST）、激光掃描細(xì)胞計(jì)量?jī)x（Laserscanning cytometry，LSC）、自動(dòng)細(xì)胞顯像系統(tǒng)(antomated cellular imaging system，ACIS)等，使檢測(cè)系統(tǒng)有了很好的協(xié)同性，能完成高速掃描、準(zhǔn)確定位免疫熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，有效提高了掃描熒光染色細(xì)胞的有效率和敏感性[11]。雖然如此，腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)的不均一性，在一定程度上降低了檢測(cè)的敏感性。

 

2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

 

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CTCs是基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后DNA水平的異常, 這些mRNA不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，所以在外周血中檢測(cè)到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。RT-PCR檢測(cè)CTCs是在PCR基礎(chǔ)上擴(kuò)增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而識(shí)別組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后RNA水平的異常。這些mRNA幾乎不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，所以在外周血中檢測(cè)到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。目前，RT-PCR的靈敏度已經(jīng)很高，在晚期癌癥患者的外周血中，RT-PCR技術(shù)可以從每毫升血液中檢測(cè)到單個(gè)腫瘤細(xì)胞。Wang等在乳腺癌中利用以KRT19和ERBB2作為目的基因進(jìn)行雙相RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雙相RT—PCR檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的敏感性比免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)要高，而且特別在早期乳腺癌尤為明顯[12]。但是，由于mRNA的不穩(wěn)定性、取樣時(shí)上皮細(xì)胞的污染、腫瘤標(biāo)志物在外周血的非正常表達(dá)以及假基因干擾等因素的影響，可致假陽(yáng)性。同時(shí)該方法無(wú)法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及腫瘤細(xì)胞的定量限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

 

2.3 流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，FCM）

 

是一項(xiàng)集激光、電子物理學(xué)、計(jì)算機(jī)、流體動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等方法為一體的細(xì)胞分析技術(shù)。它利用腫瘤細(xì)胞單抗結(jié)合熒光物質(zhì)使腫瘤細(xì)胞染色，然后用流式細(xì)胞儀分析，染色細(xì)胞被視為陽(yáng)性，大致敏感性為1/105。此技術(shù)可以對(duì)外周血樣本的CTCs進(jìn)行精確定量技術(shù)，并可以檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。近來(lái)高通量FCM（如Fishman-R microfluidic FCM）以及新腫瘤標(biāo)志物（如EGFR、磷酸化EGFR）的應(yīng)用大大提高了流式細(xì)胞術(shù)的診斷效率[13]。

 

2.4 CTCs芯片技術(shù)（CTCs-Chip）

 

CTCs芯片系統(tǒng)富集得到的CTCs采用相同的分析方法，由于CTCs并不表達(dá)白細(xì)胞的共同抗原CD45，該檢測(cè)系統(tǒng)采用不同熒光標(biāo)記的抗EpCAM抗體、抗EGFR抗體、抗細(xì)胞角蛋白CK-8、CK-18和CK-19抗體以及核熒光染料DAPI作為陽(yáng)性指標(biāo)，CD45作為陰性指標(biāo)?？稍?/span>10億以上血細(xì)胞檢測(cè)出單個(gè)癌細(xì)胞，敏感性非常高，并適用于所有類(lèi)型腫瘤患者的外周血樣本。該方法大大提高了敏感性和從全血中捕獲稀少細(xì)胞的得率, 同時(shí)操作過(guò)程簡(jiǎn)單溫和，從而使分離到的CTCs保持活力。目前第二代CTCs-Chip技術(shù)（Hchipherrin one—chip），不僅改進(jìn)了該芯片構(gòu)造，使血液標(biāo)本流經(jīng)芯片時(shí)形成微漩渦，增加了芯片表面包被抗體捕獲CTCs的機(jī)會(huì)，更加有效捕獲數(shù)量極少的CTCs，可捕獲血液中90%以上的癌細(xì)胞，而且該芯片還安裝了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)載玻片，可使用傳統(tǒng)病理檢查方法鑒別癌細(xì)胞[14]。

 

3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的臨床應(yīng)用

 

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)腫瘤早期就可以發(fā)生并可以在外周血中檢測(cè)到，已經(jīng)開(kāi)始用于腫瘤的輔助診斷。近年來(lái)，CTC檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用使之成為了國(guó)際腫瘤分期系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)之一。2007年美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)（ASCO）首次將CTC納入腫瘤檢測(cè)標(biāo)志物[15]。CTCs作為一種全新的腫瘤生物標(biāo)志物，在疾病早期階段有助于良、惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤早期診斷、輔助診斷與腫瘤分期、判斷患者預(yù)后，治療過(guò)程中可用以進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)以及指導(dǎo)個(gè)體化治療。但必須認(rèn)識(shí)到：自2004年美國(guó)強(qiáng)生公司Veridex開(kāi)發(fā)的Cellsearch CTC檢測(cè)技術(shù)獲得美國(guó)FDA認(rèn)證（準(zhǔn)入應(yīng)用于預(yù)測(cè)有轉(zhuǎn)移性的乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌的無(wú)進(jìn)展存活率和總存活率）以來(lái)，其它眾多廠家推出的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)儀器都未獲得相關(guān)認(rèn)證或準(zhǔn)入，對(duì)惡性腫瘤的應(yīng)用領(lǐng)域也未在更廣的腫瘤類(lèi)型中獲得準(zhǔn)入。目前，更多的報(bào)道尚處于臨床研究階段。但是，CellSearch CTC檢測(cè)系統(tǒng)2015年底已告停產(chǎn)的傳聞也從側(cè)面反映了為“腫瘤患者的科學(xué)算命”中“算命”的份量更重一些。

 

乳腺癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是主要的致死因素。CTCs的檢測(cè)對(duì)乳腺癌預(yù)后判斷、監(jiān)測(cè)病情和早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移等具有重要臨床意義。Biggers等檢測(cè)了41例早期乳腺癌患者，其中10例（24.4%）在術(shù)前已可檢測(cè)到CTCs。研究表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前、治療中和治療后的CTCs水平均與其預(yù)后密切相關(guān)，CTCs可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子。有研究報(bào)道采用黏蛋白1（mucin 1，MUC1）和CK19共同作為檢測(cè)乳腺癌CTCs的標(biāo)志物，用EPISPOT檢測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）患者中CTCs分泌的MUC1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有被檢者的結(jié)果均為陽(yáng)性，而健康人群中卻無(wú)法檢測(cè)得到。龔福生等的研究顯示，62例乳腺癌患者CTCs的陽(yáng)性率與TNM分期、Ki-67和HER-2表達(dá)與否顯著相關(guān)，而與月經(jīng)狀態(tài)、ER和PR表達(dá)與否無(wú)關(guān)[16]。本研究在I期患者中有1例檢出CTCs（16.7%），提示癌細(xì)胞擴(kuò)散可以出現(xiàn)在早期患者中。因此，檢測(cè)乳腺癌CTCs有助于及早確定復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的高危患者，通過(guò)及時(shí)治療干預(yù)，可以阻止腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。研究表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前、治療中和治療后的CTCs水平均與其預(yù)后密切相關(guān)，CTCs可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子。

 

臨床上結(jié)直腸癌的CTCs檢測(cè)主用是針對(duì)于上皮細(xì)胞EpCAM標(biāo)志以及標(biāo)志物CKl9、CK20、CEA等。研究發(fā)現(xiàn)，CTCs對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，在結(jié)直腸癌早期患者外周血中就能檢測(cè)到CTCs，提示CTCs檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷有所幫助。CTCs的存在與腫瘤原發(fā)灶分化程度無(wú)相關(guān)性，但與其臨床分期具有相關(guān)性。Sastre等[17]使用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)94例大腸癌患者的外周血CTCs，將CTCs≥2個(gè)/7.5mL外周血定義為陽(yáng)性，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為36.2％（34/94），CTCs陽(yáng)性率與結(jié)腸癌的臨床分期相關(guān)（II期20.7％，Ⅲ期24.1％，IV期0.7％，P=0.005）。Cohen SJ等研究認(rèn)為CTCs檢測(cè)的臨界值>3個(gè)細(xì)胞最有價(jià)值，成為治療前和治療中結(jié)直腸癌無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）和總的生存時(shí)間（OS）的觀測(cè)指標(biāo)[18]。

 

CTCs在局限性前列腺癌的臨床應(yīng)用中目前仍存在一定爭(zhēng)議，但在進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可。Danila等[19]對(duì)120例去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者外周血采用cellSearch系統(tǒng)進(jìn)行CTCs檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基線CTcs計(jì)數(shù)及化療過(guò)程中數(shù)目的變化與總生存期的關(guān)系；研究發(fā)現(xiàn)，99例血樣（82％）中檢測(cè)到CTCs，其中69例血樣（57％）基線CTCs計(jì)數(shù)≥5，且治療前后CTCs計(jì)數(shù)均≥5的患者預(yù)后較差，治療后CTCs計(jì)數(shù)<5的患者有著相對(duì)較好的預(yù)后，說(shuō)明CTCs計(jì)數(shù)及治療后數(shù)目的變化均是總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素[20]。Onstenk等[21]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)去勢(shì)治療抵抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌，在腫瘤治療的不同時(shí)間點(diǎn)，外周血CTCs計(jì)數(shù)是其總存活率的較強(qiáng)的、獨(dú)立預(yù)后因素，而且作為早期標(biāo)志物，CTCs比傳統(tǒng)的血清PSA水平檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì)。

 

目前，傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)志物如AFP、CAl9-9、CEA、CAl25的聯(lián)合檢測(cè)不能早期反映腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，而CTCs的特異性和敏感性均高于傳統(tǒng)方法。2004年Vona等[22]首先利用ISET法對(duì)44例肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行了CTCs檢測(cè)的臨床應(yīng)用的研究。44例患者中，有23例檢出了CTCs，檢出率為52%，而在健康志愿者、慢性活動(dòng)性肝炎及肝硬化患者中未檢出CTCs。近來(lái)的研究表明，肝癌患者病情狀態(tài)與血液中CTC的數(shù)量也顯示出極強(qiáng)的相關(guān)性。Sun等[23]對(duì)123例HCC患者的CTCs研究發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測(cè)可作為肝癌患者術(shù)后治療效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并有望成為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。Labgaa等[24]總結(jié)了肝癌CTCs相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為外周血CTCs與包括肝癌TNM分期、Okuda分期、BCLC分期、Milan分期在內(nèi)的肝癌分期呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外周血CTCs也與門(mén)靜脈癌栓、微血管癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，與患者性別、年齡、有無(wú)肝硬化、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)；手術(shù)前CTCs陽(yáng)性的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度較CTCs陰性的患者顯著升高；且腫瘤預(yù)后與CTCs數(shù)量有顯著關(guān)系，外周血中CTC數(shù)目越多，患者的無(wú)病生存期（Disease-free survival，DFS）和總生存期（Overall survival，OS）越短，預(yù)后越差。

 

肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷一直是困擾著臨床的難題之一。在早期肺癌（腫瘤直徑小于0.1cm），其外周血中就可檢出CTCs，可為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)及診斷提供重要依據(jù)。Allard等[25]采用Cellsearch系統(tǒng)檢測(cè)了99例肺癌患者（大多為NSCLC）的168個(gè)樣品，結(jié)果顯示，肺癌患者外周血中CTCs數(shù)目≥2、≥5、≥10和≥50的患者分別占總患者的20%、14%、10%和6%，平均60%的肺癌患者外周血中存在CTCs。研究發(fā)現(xiàn)，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞存在以及數(shù)量與肺癌腫瘤分期具有相關(guān)性。Chen等[26]對(duì)473例NSCLC、227例良性肺部疾病以及56例健康對(duì)照的CTCs研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組CTCs水平明顯高于良性肺部疾病組，具有較高的敏感性（22.46%）和特異性（88.65%）。與Tanaka等的研究發(fā)現(xiàn)一致，其對(duì)125例肺部惡性腫瘤和25例肺部非惡性腫瘤患者研究結(jié)果顯示肺部惡性腫瘤患者的CTCs計(jì)數(shù)明顯高于非惡性腫瘤患者，并且SCLC患者CTC計(jì)數(shù)顯著高于NSCLC患者，CTC計(jì)數(shù)隨著肺癌分期的增高而明顯增多，尤以Ⅳ期且伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者CTC計(jì)數(shù)最高。也有研究發(fā)現(xiàn)CTCs水平隨腫瘤直徑增大、分化程度降低、骨轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而升高。Nagrath等發(fā)現(xiàn)在評(píng)估化療的療效上，CTCs數(shù)量的改變與按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）進(jìn)行計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）檢查的結(jié)果具有高度一致性?；熐?/span>CTCs計(jì)數(shù)高的患者預(yù)后差，化療后CTCs計(jì)數(shù)下降多的患者，化療效果較好，死亡風(fēng)險(xiǎn)降低，提示CTCs對(duì)廣泛期的小細(xì)胞肺癌具有預(yù)測(cè)作用，并且化療后CTCs計(jì)數(shù)的改變可以提供有價(jià)值的臨床信息，指導(dǎo)后續(xù)治療。

 

早期胃癌往往臨床癥狀不明顯，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，已到中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)。因此早期診斷、治療胃癌是提高患者生存率的關(guān)鍵。CTCs對(duì)胃癌特別是早期胃癌的發(fā)現(xiàn)及診斷目前尚處于探索和研究階段。李熳等對(duì)45例胃癌患者CTCs進(jìn)行了檢測(cè)，其中27例（60%）檢出有CTCs，CTCs陽(yáng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位和TNM分期、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)[27]。曹中正等于2014年報(bào)道了運(yùn)用免疫磁珠法陰性富集CTCs并行免疫熒光原位雜交檢測(cè)技術(shù)[28]。41例胃癌患者中CTCs陽(yáng)性率為63.4%，24例良性胃?。ㄎ笣兓蚵晕秆祝┗颊?/span>CTCs陽(yáng)性率為8.3%。且發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中CTCs水平升高與TNM分期無(wú)關(guān)，胃癌早期階段外周血中便可檢出CTCs，提示可能在腫瘤早期階段即發(fā)生微轉(zhuǎn)移。Hiraiwa等利用CellSearch System發(fā)現(xiàn)外周血中CTCs≥2組總生存率顯著低于CTCs<2組；Matsusaka等人則發(fā)現(xiàn)CTCs≥4組的化療病人總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期要顯著小于CTCs<4組，提示CTCs水平也許與化療藥物治療反應(yīng)相關(guān)。

 

4 主要循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)儀器簡(jiǎn)介

 

美國(guó)FDA在2004年、2007年和2008年分別批準(zhǔn)了美國(guó)強(qiáng)生公司子公司Veridex開(kāi)發(fā)的Cellsearch CTCs檢測(cè)技術(shù)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌與前列腺癌的預(yù)后評(píng)估、無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)測(cè)。Cellsearch也是目前唯一被FDA批準(zhǔn)用于臨床的檢測(cè)系統(tǒng)。2007年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology，ASCO）將CTCs納入了腫瘤標(biāo)志物范疇；2012年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）批準(zhǔn)Veridex的CellSearch系統(tǒng)用于檢測(cè)CTCs以評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后；2013年CTCs檢測(cè)被納入美國(guó)醫(yī)保；2016年初CFDA批準(zhǔn)了格諾思博生物科技有限公司自主研發(fā)的首個(gè)肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)-葉酸受體陽(yáng)性CTC檢測(cè)試劑盒（注冊(cè)證編號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20163400061）。該試劑盒采用了國(guó)內(nèi)原創(chuàng)的靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù)，顯著提高了CTC檢測(cè)的敏感性。

 

自2004年，Cellsearch檢測(cè)系統(tǒng)獲得美國(guó)FDA的認(rèn)證后，10多年間CTCs檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)儀器突飛猛進(jìn)，涌現(xiàn)了許多專(zhuān)注于CTCs診斷的公司，生產(chǎn)的檢測(cè)儀器品牌有四十幾種之多[29]，包括強(qiáng)生Veridex公司、凱杰公司（Qiagen）、Epic Sciences、CytoTrack、Codiak BioSciences、Illumina、Thermo Fisher以及Celsee Diagnostics等等。以下簡(jiǎn)介幾種作者認(rèn)為較有代表性的CTCs檢測(cè)儀器：

 

4.1 Cellsearch CTCs檢測(cè)系統(tǒng)

 

Cellsearch CTCs檢測(cè)系統(tǒng)是Veridex公司（Veridex公司是強(qiáng)生的一個(gè)子公司）專(zhuān)有的一項(xiàng)技術(shù)，是一種高效的、半自動(dòng)化的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用一種獨(dú)創(chuàng)的稱為鐵磁流體的抗體，這種鐵磁流體可同鐵微粒相結(jié)合，且與CTCs表面的EpCAM+/CK+/CD45+等受體有極強(qiáng)的特異性結(jié)合的能力，系統(tǒng)用磁場(chǎng)將CTCs分離之后進(jìn)行生物或化學(xué)染色，細(xì)胞表面具有EpCAM+/CK+/CD45+被識(shí)別為腫瘤細(xì)胞。該系統(tǒng)包括三部分：⑴細(xì)胞收集保存管：采集并完善保存細(xì)胞使樣本可在室溫下保存小時(shí)，方便批量處理和遠(yuǎn)途運(yùn)輸；⑵樣本準(zhǔn)CellTracks? AutoPrep?系統(tǒng)：采用自動(dòng)化可復(fù)驗(yàn)的樣本準(zhǔn)備，可自動(dòng)化樣本快速分析，以得到更精確的結(jié)果；⑶樣本分析CellTracksAnalyzer II?系統(tǒng)：可自動(dòng)化樣本快速分析。Cellsearch CTCs檢測(cè)系統(tǒng)既可以用于體外診斷也可供研究使用，同時(shí)將微量細(xì)胞進(jìn)行分析的過(guò)程半自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，使其成為一個(gè)簡(jiǎn)單的三步流程。

 

4.2 Celsee PREP

 

Celsee PREP是美國(guó)Celsee Diagnostics公司生產(chǎn)的全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集和檢測(cè)平臺(tái)。其產(chǎn)品包括CTC富集和檢測(cè)系列CelseePREP100 、Celsee PREP400以及圖像分析儀Celsee ANALYZER。與其它免疫學(xué)與免疫磁珠、離心等富集分析方法不同，其而不依賴于特定的標(biāo)志物，而是通過(guò)腫瘤細(xì)胞的物理特性來(lái)捕獲富集。在現(xiàn)有使用過(guò)濾方法富集CTC的產(chǎn)品中，Celsee是第一個(gè)無(wú)需預(yù)先去除紅細(xì)胞、高度自動(dòng)化、高效率富集CTC的產(chǎn)品，并將細(xì)胞富集系統(tǒng)與細(xì)胞鑒定和分析系統(tǒng)整合到一起。該系統(tǒng)能夠處理全血液樣本，不需要提前預(yù)處理。Celsee PREP400利用微流體動(dòng)力學(xué)，能實(shí)現(xiàn)多通道全自動(dòng)化處理血液樣本，是多通道全自動(dòng)的CTC富集和檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)從樣品到結(jié)果的一步到位。Celsee PREP產(chǎn)品能在不添加標(biāo)記、不依賴于特定標(biāo)志物的情況下實(shí)現(xiàn)CTC富集和回收，并能直接對(duì)富集的細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)、DNA FISH、或者mRNA FISH等實(shí)驗(yàn)并能保證細(xì)胞活性。Celsee ANALYZER的五色成像系統(tǒng)可對(duì)CTC特征、數(shù)量和細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行高度自動(dòng)化、高通量的分析，以便研究人員更好地理解癌細(xì)胞的突變和異質(zhì)性。

 

4.3 CytoQuestTM

 

亞諾法（Abnova）[30]推出的CytoQuestTM CR是以分子親和力為基礎(chǔ)，利用對(duì)溫度敏感的奈米柱陣列捕捉及釋放循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）的平臺(tái)。CytoQuestTM CR能夠提供高純度、高存活率的循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTCs) 以進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記（protein biomarker）辨識(shí)及基因分析，如熒光原位雜交（FISH）、微陣列以及次世代測(cè)序技術(shù)（NGS）。對(duì)臨床醫(yī)學(xué)研究而言，CytoQuestTM CR是一個(gè)威力強(qiáng)大的輔助工具，能夠幫助辨識(shí)與追蹤癌細(xì)胞的變化和轉(zhuǎn)移。

 

5 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的展望

 

早期準(zhǔn)確地檢測(cè)CTC對(duì)合理地進(jìn)行綜合治療至關(guān)重要，并可作為治療效療評(píng)估指標(biāo)及加強(qiáng)輔助化療的選擇性指標(biāo)，有助于建立個(gè)體化治療方案。然而CTCs是非常罕見(jiàn)的，只是血液中循環(huán)細(xì)胞的一小部分，因此除了計(jì)數(shù)以外的分子分析從技術(shù)上來(lái)說(shuō)非常具有挑戰(zhàn)性。發(fā)現(xiàn)CTCs生物學(xué)的全貌有助于靶定特異性細(xì)胞亞型，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確用藥和個(gè)性化治療的夢(mèng)想。這不是一件容易的事，因?yàn)?/span>CTCs不僅罕見(jiàn)，而且異質(zhì)性是腫瘤的基本特性。盡管目前在CTCs研究方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是多種分離富集與檢測(cè)方法仍難以滿足臨床實(shí)際工作的需要，每種技術(shù)的結(jié)果難以統(tǒng)一，理論和實(shí)踐上都需要制定行業(yè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。如何進(jìn)一步提高CTCs檢測(cè)敏感性及特異性、發(fā)展適應(yīng)臨床CTCs快速診斷需要的高通量、自動(dòng)化儀器、完善CTCs檢測(cè)程序及標(biāo)準(zhǔn)化是今后研究的主要方向。CTCs檢測(cè)的前景不僅僅在于其對(duì)腫瘤的診斷、治療、監(jiān)測(cè)，分選出的CTCs對(duì)化療藥物敏感性檢測(cè)用于指導(dǎo)個(gè)體化治療是臨床亟需和期盼的。