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循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的現(xiàn)狀及發(fā)展

來源: | 作者:admin | 發(fā)布時(shí)間: 2018-06-14 | 3737 次瀏覽 | 分享到:

Density Gradient Centrifugation，DGC）

密度梯度離心的原理是基于血液中各種正常細(xì)胞與CTCs密度的差別，利用其在密度梯度介質(zhì)（如Ficoll-Paque介質(zhì)、OnceQuick系統(tǒng)）中的沉降系數(shù)不同，將細(xì)胞懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力的作用，用分離液將CTCs與其它細(xì)胞層分離。離心后在細(xì)胞分離液中各種細(xì)胞呈現(xiàn)梯度分布，依次為：血漿成分、單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）、分離液、中性粒細(xì)胞和最下層的紅細(xì)胞，從而獲取目標(biāo)細(xì)胞。有報(bào)道用OnceQuick系統(tǒng)分離腫瘤細(xì)胞得到了632倍的富集效果，標(biāo)明該系統(tǒng)對(duì)CTCs的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque介質(zhì)只有3.8倍。DGC方法操作簡(jiǎn)便、成本低，但該分離方法一般要求血量較大，且靈敏度和特異性均較低，且在操作過程中可能會(huì)損失CTCs。

1.2 細(xì)胞過濾技術(shù)（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

ISET方法的原理是基于細(xì)胞大小不同和機(jī)械性能的差別。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的直徑為15~30μm，大于絕大多數(shù)血細(xì)胞的直徑（如紅細(xì)胞5~9μm），根據(jù)細(xì)胞大小所設(shè)計(jì)的濾過膜濾過血液樣本后將直徑大的腫瘤細(xì)胞分離出來。但由于目前還沒有報(bào)道證實(shí)所有腫瘤細(xì)胞直徑都大于8μm，使其分離敏感性受到質(zhì)疑。該方法對(duì)技術(shù)、設(shè)備要求不高，但會(huì)丟失一小部分直徑小于濾膜孔徑的CTCs，導(dǎo)至檢測(cè)靈敏性降低。

1.3 細(xì)胞粘附技術(shù)（Cell adhesion techniques，CAT）

細(xì)胞粘附分離技術(shù)是CTCs捕獲的一項(xiàng)基本技術(shù)，利用的是親和反應(yīng)原理，即利用CTCs與生物生化修飾或物理修飾捕獲表面的親和作用，含有CTCs的樣本經(jīng)過捕獲表面時(shí)，CTCs則被吸附在捕獲表面，隨后沖洗掉未被粘附的非目的細(xì)胞，從而得到CTCs。此后發(fā)展起的多種納米及微流控技術(shù)都采用了這一基本技術(shù)。

1.4 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic separation，IMS）

與普通血細(xì)胞相比，CTCs具有某些特殊的生物標(biāo)志物，包括CTCs表面的上皮細(xì)胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及腫瘤特異性抗原，而血液中幾乎所有的細(xì)胞都是反磁性或弱磁性的，利用腫瘤細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場(chǎng)中通過相應(yīng)抗原抗體復(fù)合物與磁珠吸附而滯留在磁場(chǎng)中或定向移動(dòng)到指定區(qū)域，沒有表面抗原的其它細(xì)胞由于不能與連接磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而不能在磁場(chǎng)中停留，從而使腫瘤細(xì)胞得以從血液中分離出來[7]。該方法的敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表達(dá)的制約。例如：采用EpCAM抗體捕獲CTCs，由于EpCAM在CTCs的表達(dá)率一般為60-70%，往往會(huì)丟失部分CTCs；單一的CK抗體也不能完全識(shí)別癌細(xì)胞表達(dá)的所有CKs；在CTCs上皮間質(zhì)化過程中，一些基于標(biāo)準(zhǔn)化上皮標(biāo)志物的篩選抗體無法檢測(cè)出所有CTCs等等。這一切都受到目標(biāo)抗原的表達(dá)量與特異性以及與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力影響。

1.5 納米基質(zhì)分離技術(shù)（Nanoimprint matrix isolation technology）

納米技術(shù)在納米尺度對(duì)檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和操作，是一門融合化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)和藥學(xué)的交叉學(xué)科。通過在基底表面制備納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)細(xì)胞界面，并修飾相應(yīng)的特異性識(shí)別分子，可以將血液中的CTCs捕獲并分離出來。陸寧寧等[8]綜述了據(jù)此思路研發(fā)的技術(shù)設(shè)備有：（1）納米柱、納米線及納米纖維：在CTCs捕獲裝置中，納米柱、納米線及納米纖維基質(zhì)均可通過多種方式獲得。如利用濕法刻蝕或化學(xué)氣相沉積法可制備納米柱或納米線基質(zhì)；（2）納米粗糙表面：由于CTCs的黏附性較血液中其它細(xì)胞強(qiáng)，所以粗糙界面的構(gòu)建為CTCs高效分離提供了另外一種選擇；（3）碳納米材料：以碳納米管、石墨烯為代表的碳納米材料因具有高比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)電性能和良好的生物相容性等特點(diǎn)，成為了生物傳感器、儲(chǔ)能材料、藥物載體以及高分子等領(lǐng)域中的常用材料；（4）仿生材料：自然粒子如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和花粉，因具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)眾多優(yōu)良性能。以這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的自然粒子為模板，可制備具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的仿生材料。相對(duì)于傳統(tǒng)的CTCs分離法的分類效率及特異性有了極大的提高，并且制備簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜昂貴的微加工設(shè)備。